三种基因编辑系统的特异性如何??
ZFN和TALENs都是作为二聚体发挥作用的,其特异性是由DNA绑定的区域决定的,这个区域在每个剪切位点最多可以识别36bp。然而,在在II型CRISPR系统中的Cas9是由一种RNA引导的核酸,它的特异性是由PAM和PAM上游的20个引导核苷酸决定的。这表明,3’12个碱基的“种子序列”是最关键的,而剩下的8个碱基(非种子序开发者_开发技巧列)甚至PAM序列都是可以错配的。ZFN的特异性由一种不带偏见的全基因组分析进行,并且发现存在频率低,但是可以检测到的脱靶事件的发生,其可以定义为一个高度有限的一部分。
已经有研究表明,TALENs有比ZFN更低的细胞毒性和脱靶效率。基于这个研究,TALENs诱导的CCR5特异性突变在CCR5的对偶基因上发生率是17%,而在高度同源的CCR2位点上只有1%。相反,CCR5特异性的ZFN的活性在这两个位点是相在当的,CCR5位点的突变频率是14%,而CCR2的是12%。CRISPR/Cas系统在细胞毒性评价或者DSB诱导的检测中都没有明显的脱靶现象。然而,最近的研究发现,CRISPR诱导的靶向不同的人类细胞的基因出现了显著的脱靶现象。三个其他的小组利用更系统的方法在人类细胞中评估了CRISPR的脱靶活性,其结果表明CRISPR可能能够发生目标不匹配,从而在预测的脱靶位点上引入微缺失或者插入(插入缺失)。此外,靶向位点的定位和内涵能够显著的影响gRNA识别他们的靶向目标,而在基因组序列中的“脱靶序列”也是一样的。已经有报告说,脱靶效应能够通过小心的控制Cas9的mRNA的浓度来克服。此外,在基因编辑的时候使用配对的Cas9的切口酶已经表明能够显著的减少至少1500倍的脱靶活性。
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