在PCR操作过程中应注意哪些？？

张会峰 2021-08-09 18:06

1：避免交叉污染——勤换枪头和高压枪头和PCR管。
2：引物设计要正确，选择可靠的生物公司合成引物，如果公司不好，给的引物会不出结果
3：DNA提取要成功。
4：引物和模板和体系所加开发者_如何学JAVA的比例要合适，模板过量会抑制体系的反应。
5：跑胶时注意区分开EB污染区和清洁区。
6：吸取试剂前不必每次都混匀，离心是为了把粘在壁上和盖上的试剂离下来。不离也没关系，可以直接用枪头吸。但是配制的时候需要充分混匀，比如溶解引物，需要先混匀再分装。
7：DNA提取之后最好4度过夜之后再做PCR，这有利于DNA的充分溶解。
大家再来补充

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ty世安 2021-08-09 18:09

1、PCR实验一定要保管好试剂，防止交叉污染，尤其是ddH2O2的交叉使用，极易引起污染。开发者_开发技巧
2、NA处理最好用硅烷化塑料管以防粘附在管壁上，所有缓冲液吸头、离心管等用前必须高压处理，常规消耗用品用后作一次性处理，避免反复使用造成污染。
3、PCR在超净台内进行，操作前后紫外灯消毒。
4、超净台内设内供PCR用微量离心机、一次性手套、整套移液器和其它必须品；移液品用一次性吸头和活塞的正向排液器，防止移液器基部污染。
5、PCR操作应戴手套并勤于更换。成套试剂，小量分装，专一保存，防止它用。配制试剂用新器具，用后作一次性处理。
6、试剂管用前先瞬时离心（10s），使液体沉于管底，减少污染手套与加样器机会。
7、最后加模板DNA（包括在石蜡油后），马上盖好，混匀，瞬时离心（10s），使水相与有机相分开。加入模板且忌喷雾污染，所有非即用管都应盖严。加模板DNA后应更换手套。
8、引物稀释时，要首先瞬时离心，以避免粉末状引物在开盖时弹出管外。
9、实验设阳性、阴性对照。

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anything 开发者_如何转开发 2021-08-09 18:15

要注意的问题太多了，
首先，在设计PCR引物时，结构要好，长度应在20bp左右，避免引物间形成引物二聚体。两条引物的退火温度尽量保持一致，最好是在55度左右。
其次，使用的DNA模板量是比较关键的，应使用纯度较高，基因组较完全，没有产生断链的基因组DNA。
然后是PCR体系中各个试剂的使用，比如说酶的纯度，活性，并且要注意酶量一定要适中，各DNTP的量要保持一致。
最后是PCR程序的设置。如果怕一开始就使用一个固定的退火温度扩增不出来，可以先小批量得试验温度梯度，或者用touchdown程序，即先设置一个较高的退火温度，这样引物的特异性结合会比较好，然后每个循环的退火温度都比上个循环低0.5度或1度，最终停留在某一个较合适的温度完成整个程序。

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